Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Massive shift in the pneumococcal nasopharyngeal flora after the 7-valent conjugate vaccine: epidemiological studies and testing pathogenic potential in animal models

Dissertation presented to obtain the PhD degree in Biology/Molecular Biology by Universidade Nova de Lisboa, Instituto de Tecnologia Química e Biológica

Development of human central nervous system 3D in vitro models for preclinical research

Neurological disorders are a major concern in modern societies, with increasing prevalence mainly related with the higher life expectancy. Most of the current available therapeutic options can only control and ameliorate the patients’ symptoms, often be-coming refractory over time. Therapeutic breakthroughs and advances have been hampered by the lack of accurate central nervous system (CNS) models. The develop-ment of these models allows the study of the disease onset/progression mechanisms and the preclinical evaluation of novel therapeutics. This has traditionally relied on genetically engineered animal models that often diverge considerably from the human phenotype (developmentally, anatomically and physiologically) and 2D in vitro cell models, which fail to recapitulate the characteristics of the target tissue (cell-cell and cell-matrix interactions, cell polarity). The in vitro recapitulation of CNS phenotypic and functional features requires the implementation of advanced culture strategies that enable to mimic the in vivo struc-tural and molecular complexity. Models based on differentiation of human neural stem cells (hNSC) in 3D cultures have great potential as complementary tools in preclinical research, bridging the gap between human clinical studies and animal models. This thesis aimed at the development of novel human 3D in vitro CNS models by integrat-ing agitation-based culture systems and a wide array of characterization tools. Neural differentiation of hNSC as 3D neurospheres was explored in Chapter 2. Here, it was demonstrated that human midbrain-derived neural progenitor cells from fetal origin (hmNPC) can generate complex tissue-like structures containing functional dopaminergic neurons, as well as astrocytes and oligodendrocytes. Chapter 3 focused on the development of cellular characterization assays for cell aggregates based on light-sheet fluorescence imaging systems, which resulted in increased spatial resolu-tion both for fixed samples or live imaging. The applicability of the developed human 3D cell model for preclinical research was explored in Chapter 4, evaluating the poten-tial of a viral vector candidate for gene therapy. The efficacy and safety of helper-dependent CAV-2 (hd-CAV-2) for gene delivery in human neurons was evaluated, demonstrating increased neuronal tropism, efficient transgene expression and minimal toxicity. The potential of human 3D in vitro CNS models to mimic brain functions was further addressed in Chapter 5. Exploring the use of 13C-labeled substrates and Nucle-ar Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy tools, neural metabolic signatures were evaluated showing lineage-specific metabolic specialization and establishment of neu-ron-astrocytic shuttles upon differentiation. Chapter 6 focused on transferring the knowledge and strategies described in the previous chapters for the implementation of a scalable and robust process for the 3D differentiation of hNSC derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC). Here, software-controlled perfusion stirred-tank bioreactors were used as technological system to sustain cell aggregation and dif-ferentiation. The work developed in this thesis provides practical and versatile new in vitro ap-proaches to model the human brain. Furthermore, the culture strategies described herein can be further extended to other sources of neural phenotypes, including pa-tient-derived hiPSC. The combination of this 3D culture strategy with the implemented characterization methods represents a powerful complementary tool applicable in the drug discovery, toxicology and disease modeling.

The role of arl13b in cilia length regulation and in zebrafish development

RESUMO: Arl13b é uma importante proteína ciliar, presente em cílios primários e cílios móveis. Ratinhos mutantes para Arl13b têm comprimento dos cílios reduzido e defeitos nos B-túbulos dos cílios. Como consequência destes fenótipos, deficiências na Arl13b originam, em modelos animais, várias doenças congénitas, incluindo problemas no estabelecimento do eixo esquerda-direita, malformações cerebrais e deformações corporais. Nos seres humanos, deficiências na Arl13b levam a uma doença crónica congénita chamada Síndrome de Joubert. Por outro lado, a sobreexpressão de Arl13b origina cílios mais longos, no entanto existe uma ausência da caracterização dos fenótipos celulares e durante o desenvolvimento embrionário. Neste trabalho, quisemos explorar o efeito da sobre-expressão de Arl13b em embriões de peixezebra. Descobrimos que, ao nível ciliar, a sobre-expressão de Arl13b nas células aumenta o comprimento ciliar em cílios primários e móveis, no entanto, a esses cílios falta adequada acetilação da alfa-tubulina no citoesqueleto feito por microtúbulos. Os nossos resultados mostraram que esse efeito é específico de Arl13b sobre-expressão e quando se manipularam as enzimas responsáveis pela acetilação (Mec17) e pela de-acetilação (HDAC6) encontrámos uma sinergia potencial com ambas. Testámos ainda, que o aumento no comprimento ciliar não estava causalmente relacionado com a falta de acetilação, ou seja, os cílios com menos acetilação não eram necessariamente os mais longos. Também mostrámos que a sobre-expressão de Arl13b é capaz de restaurar o comprimento dos cílios em mutantes com cílios curtos e como isso pode ser explorado para um futuro potencial papel terapêutico para Arl13b. Em seguida, foi avaliado o impacto do aumento da quantidade de Arl13b no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Observou-se que a sobre-expressão de Arl13b apresentava fenótipos muito fracos, quando comparados com a perda de função dos mutantes de Arl13b. Focados no inesperado fenótipo leve no estabelecimento do eixo esquerda-direita abordámos a questão através do estabelecimento de uma colaboração com matemáticos, descobrimos que os cílios mais longos que potencialmente têm a capacidade de movimentar mais fluido são atenuados por amplitudes de batimento menores, e, como resultado, estes longos cílios não prejudicam o movimento do fluido e consequentemente não afetam o estabelecimento dos padrões de esquerda-direita. Sugerimos assim que a Arl13b é um regulador chave, do comprimento ciliar. Descobrimos uma nova interação com as enzimas de acetilação/de-acetilação e levantamos novas hipóteses quanto aos mecanismos moleculares da função da Arl13b. Propomos um novo modelo para o mecanismo molecular da Arl13b na regulação do comprimento dos cílios onde podemos integrar os nossos resultados com os relatados na literatura. Este trabalho adiciona mais conhecimento para o mecanismo de ação da Arl13b e, portanto, fornece uma importante contribuição para o campo da investigação em cílios.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Arl13b is an important ciliary protein, present in primary and motile cilia. arl13b-/- mouse mutants have reduced cilia length and cilia B-tubule defects. As a consequence of these phenotypes, Arl13b loss of function animal models suffer from several congenital disorders including left-right problems, brain malformations and body deformations. In humans Arl13b depletion leads to a congenital chronic disease called Joubert Syndrome. On the other hand, overexpressing Arl13b leads to longer cilia but the characterization of the cellular and developmental phenotypes was missing. In this work we explore the effect of Arl13b overexpression in zebrafish embryos. We found that, at the ciliary level, Arl13b overexpression from 1 cell stage produces longer primary and motile cilia, but these cilia lack proper alpha tubulin acetylation of their microtubule cytoskeleton. Our results showed that this effect is specific from Arl13b overexpression and when we manipulated the enzymes responsible for acetylation, Mec17, and de-acetylation, HDAC6, we found a potential synergy of both mec17 knockdown and HDAC6 activity with Arl13b overexpression. We tested that the ciliary increase in length was not causally related to the lack of acetylation, meaning the more de-acetylated cilia were not necessarily the longer ones. We also showed that Arl13b overexpression is able to restore cilia length in short cilia mutants and how that may be explored to a potential future therapeutic role for Arl13b. Next, we evaluated the impact of increasing the amount of Arl13b in zebrafish embryonic development. We observed that Arl13b overexpression presented very mild phenotypes when compared to the loss of function mutants. We focused on the unexpected left-right mild phenotype and by establishing a mathematical modeling collaboration, we found out that the longer cilia generated force was attenuated by smaller beating amplitudes, and as a result, these long cilia were not impairing the cilia generated flow and the establishment of left-right patterning. We suggest that Arl13b is one key cilia length regulator. We disclosed a novel interaction with the acetylation / de-acetylation enzymes and raised new hypothesis as to the mechanisms of Arl13b function. We propose a new model for the Arl13b molecular mechanism of cilia length regulation where we integrate our findings with those reported in the literature. This work adds more knowledge to the Arl13b mechanism of action and therefore provides an important contribution to the cilia research field.